1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛胚胎移植的主要技術(shù)。包括供體牛選擇、超排處理、人工授精、胚胎收集、受體牛準(zhǔn)備、移植、妊娠診斷等。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于通遼地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)（戶）。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
NY/T 815 肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)
DB1505/T 065 科爾沁肉牛獸醫(yī)防疫準(zhǔn)則
DB1505/T 067 牛冷凍精液人工授精技術(shù)規(guī)范
DB1505/T 074 牛妊娠診斷規(guī)程
3 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1 供體
提供胚胎的母牛。
3.2 受體
接受胚胎并代之完成妊娠、分娩、哺乳犢牛的母牛。
3.3 同期發(fā)情
同期發(fā)情又稱同步發(fā)情，就是利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情。
3.4 超數(shù)排卵
在母牛發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)期，注射促性腺激素，使卵巢上比自然生理狀態(tài)下有更多的卵泡發(fā)育并排卵的方法簡(jiǎn)稱“超排”。
3.5 沖胚
利用沖卵液將胚胎沖出，并收集在器皿中。
3.6 檢胚
指對(duì)沖出的胚胎的完整性、活力進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)并鑒定等級(jí)。
4 供體牛的選擇標(biāo)準(zhǔn)
4.1 譜系清楚，生產(chǎn)性能優(yōu)良，種用價(jià)值高。
4.2 繁殖性能良好，有連續(xù)2個(gè)或2個(gè)以上正常發(fā)情周期。
4.3 營(yíng)養(yǎng)狀況好，膘情中上等。
4.4 無(wú)生殖系統(tǒng)疾病和傳染性疾病。
4.5 與配種公牛必須是經(jīng)過(guò)后裔測(cè)定的優(yōu)秀個(gè)體，育種值排名靠前。
5 受體牛的準(zhǔn)備
5.1 受體牛選擇
可選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常、健康無(wú)病、乳房發(fā)育良好、繁殖力較強(qiáng)、體格適中的母牛，最好是經(jīng)產(chǎn)母牛。
5.2 組群
5.2.1 外購(gòu)受體牛應(yīng)來(lái)自非疫區(qū)，并經(jīng)獸醫(yī)部門(mén)檢疫合格的健康空懷母牛。
5.2.2 外購(gòu)母牛隔離、免疫、驅(qū)蟲(chóng)執(zhí)行DB1505/T 065。
5.2.3 受體牛佩戴耳標(biāo)。
5.3 受體牛的飼養(yǎng)管理
5.3.1 受體牛的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)參照NY/T 815。
5.3.2 詳細(xì)觀察受體牛的日常行為、發(fā)情狀況、健康狀態(tài)。
5.4 受體牛的同期發(fā)情
5.4.1 受體牛的發(fā)情時(shí)間與供體牛超排后的發(fā)情時(shí)間應(yīng)確保一致，前后不超過(guò)1d。
5.4.2 同期發(fā)情方法
前列腺素（PGF2α）法：一次注射法是在發(fā)情周期的第9d注射PGF2α，通常在2d～3d內(nèi)發(fā)情。在不清楚發(fā)情周期的情況下采用兩次注射法，即第一次注射后間隔10d～12d再進(jìn)行第二次注射。約90%于注射后24h～48h發(fā)情。
孕激素法：每日肌注或口服孕酮類似物如氯前列烯醇（PGC）2ml或0.2mg。處理12d～18d，停藥2d～3d后出現(xiàn)發(fā)情。
5.4.3 受體牛發(fā)情鑒定方法與供體牛相同。
6 供體牛的超排處理
6.1 通常采用促卵泡素（FSH）+前列腺素（PG）法。
6.2 程序
供體牛發(fā)情后的第9d～13d 肌注FSH，以日遞減法連續(xù)注射4d，每天早晚等量注射2次（每隔12h），使用總劑量按照牛的體重、胎次作適當(dāng)調(diào)整。詳見(jiàn)表1。
表1 發(fā)情9d～13d超排處理及藥物劑量表
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激 素 |
產(chǎn) 地 |
起始注射量（mg） |
連續(xù)注射4d每日遞減（mg） |
|
|
經(jīng)產(chǎn)牛 |
育成牛 |
|||
|
FSH |
國(guó)產(chǎn) |
8～10 |
6～8 |
0.2～0.4 |
|
進(jìn)口 |
300～400 |
200～300 |
20 |
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表1（續(xù)）
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PG 氯前列烯醇 |
肌注 |
注射FSH 5～6針后 |
0.4～0.6 |
|
子宮灌注 |
注射FSH 5～6針后 |
0.2～0.3 |
超排藥品的劑量和比例應(yīng)根據(jù)不同廠家和批號(hào)作調(diào)整。
7 供體牛的人工授精
7.1 發(fā)情鑒定
供體牛超排處理后，一般12h～48h出現(xiàn)發(fā)情征兆。發(fā)情鑒定執(zhí)行DB1505/T 067。
7.2 配種
執(zhí)行DB1505/T 067。
8 胚胎收集
8.1 方法
采用非手術(shù)法。
8.2 準(zhǔn)備
8.2.1 回收胚胎在配種后6d～8d進(jìn)行。沖胚前一天開(kāi)始停飼并限制飲水，以減輕沖胚操作時(shí)腹壓和瘤胃壓力的影響。
8.2.2 準(zhǔn)備好沖胚器械和沖卵液。沖卵液使用杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBSS）,其成分和配方見(jiàn)附錄A。
8.3 供體牛的保定與消毒。
保定供體牛，用2%鹽酸利多卡因或普魯卡因進(jìn)行薦尾椎硬膜外麻醉，用18號(hào)針頭，每頭牛約5ml。應(yīng)將外陰部及陰唇清洗消毒，再用消毒過(guò)的紙巾擦干。
8.4 胚胎回收
8.4.1 固定沖卵器
供體牛尾部麻醉后，操作者一只手伸入直腸握住子宮頸，另一只手持內(nèi)管穿插有金屬探針的雙通式或三通式導(dǎo)管沖卵器，使其依次通過(guò)陰門(mén)、陰道、子宮頸和子宮體，最后頭部抵達(dá)一側(cè)子宮角的基部。然后通過(guò)充氣孔充氣15ml～20ml，使其頭部的氣囊膨脹以固定在子宮角內(nèi)腔的基部，以免沖卵液流入子宮體并沿子宮頸流出。
8.4.2 注入沖卵液
將D-PBSS 沖卵液吊瓶掛在距母牛外陰上方0.8m～1m高處，接三通管和沖卵管，用進(jìn)流開(kāi)關(guān)和出流開(kāi)關(guān)控制流量，每次灌注30ml～50ml D-PBSS沖卵液，單側(cè)總量為300ml～500ml。也可用50ml一次性注射器分次注射和抽吸（劑量為30ml～50ml），具有相同的沖排效果。另側(cè)子官?zèng)_胚時(shí)應(yīng)先重新插入鋼芯和放氣，將其移入另側(cè)子官角后用同樣方法沖胚。沖胚結(jié)束后放氣，將采卵管移入子宮體后，在子宮體推注抗生素（如土霉素100萬(wàn)IU 或?qū)m乳康10ml～20ml），肌注氯前列烯醇（PGC）0.4mg，間隔12h 后再用0.4mg。
9 胚胎檢查
9.1 檢胚
采用漏斗法接收回收液，靜置10min，等胚胎下沉后移去上層液，可將最后留在斗中的回收液倒入玻璃皿中直接撿胚，撿到胚胎應(yīng)及時(shí)移入含有10%～20%犢牛血清的D-PBSS培養(yǎng)液中；進(jìn)行凈化處理，對(duì)回收的胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定確定等級(jí)。
從回收液中撿胚可用實(shí)體顯微鏡放大16倍～20倍。將找到的胚胎用吸管撿出放入裝有D-PBSS保存液的器皿中，按順序依次輕輕吸胚、清洗，可先吸些D-PBSS吹向胚的周圍，使胚在液滴中翻騰，清除卵周圍的黏連物，一般需清洗3次。
9.2 胚胎質(zhì)量鑒定
9.2.1 將凈化后的胚胎置于D-PBSS液中，放大40倍～200倍作形態(tài)學(xué)檢查。胚齡通常以母畜發(fā)情日為0天來(lái)計(jì)算，距發(fā)情日的天數(shù)即為胚齡。
9.2.2 胚胎發(fā)育特征
適于移植的胚胎胚齡為6d～8d,相對(duì)應(yīng)的胚胎發(fā)育階段為桑椹胚至囊胚，其發(fā)育表現(xiàn)為：
9.2.2.1 桑椹胚
受精后第5d～6d 回收的胚胎，能觀察到球狀細(xì)胞團(tuán)，分不清分裂球，占據(jù)透明帶內(nèi)腔的大部分。
9.2.2.2 致密桑椹胚
受精后第6d～7d 回收的胚胎，細(xì)胞團(tuán)變小，占透明帶內(nèi)腔的60%～70%。
9.2.2.3 早期囊胚
受精后第7d～8d 回收的胚胎，細(xì)胞的一部分出現(xiàn)發(fā)亮的胚泡腔，細(xì)胞團(tuán)占透明帶內(nèi)腔的70%～80%，難以分清內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層。
9.2.2.4 囊胚
受精后第7d～8d 回收的胚胎，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層界限清晰，胚泡腔明顯，細(xì)胞充滿透明帶內(nèi)腔。
9.2.2.5 擴(kuò)張囊胚
受精后第8d～9d 回收的胚胎，胚泡腔明顯擴(kuò)大，體積增至原來(lái)的1.2倍～1.5倍，與透明帶之間無(wú)空隙，透明帶變薄，相當(dāng)于正常厚度的1/3。
9.2.2.6 孵育胚
透明帶破裂，細(xì)胞團(tuán)孵出透明帶。
9.2.3 胚胎的分級(jí)
9.2.3.1 1級(jí) 優(yōu)良胚胎：形態(tài)典型，卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布極均一。
9.2.3.2 2級(jí) 普通胚胎：與典型的胚胎相比，稍有變形，但卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，變性細(xì)胞和水泡不超過(guò)10%～30%。
9.2.3.3 3級(jí) 不良胚胎：形態(tài)有明顯變異，卵細(xì)胞和分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，突出的細(xì)胞、水泡和變性細(xì)胞占30%～50%。
9.2.3.4 4級(jí) 凡總體形態(tài)結(jié)構(gòu)不正常的卵子，未受精的、退化的或破碎的卵子，透明帶空的或?qū)⒁盏穆炎?，以及與正常胚齡相比，發(fā)育遲2d或2d以上的胚胎均難以繼續(xù)正常發(fā)育，不宜移植。
10 胚胎的裝管、冷凍和解凍
10.1 裝管
10.1.1 采用一步平衡法，
冷凍保存液為含10%甘油的D-PBSS液。將胚胎在基礎(chǔ)液（PBS＋10%BSA 沖卵液）中洗滌5次～10次，在10%甘油第1液中平衡5min，在10%甘油第2液中平衡10min后裝管。
注：10％BSA 沖卵液：含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗
10.1.2 胚胎裝管方法：
將平衡好的胚胎用0.25ml 細(xì)管裝管備用。3 段法裝管的順序是：3cm 12.5%蔗糖PBS液、0.5cm氣泡、1.0cm10%甘油PBS液（含胚胎）、0.5cm氣泡、2cm12.5%蔗糖PBS液。用封口塞、聚乙醇粉末封口或熱封法將開(kāi)口端封口，按程序進(jìn)行冷凍。
10.2 冷凍
將裝入胚胎的細(xì)管放入0℃冷凍儀平衡10min，以1℃/min速度降溫，（-7～-6）℃誘發(fā)結(jié)晶，平衡10min。隨后將冷凍儀以0.5℃/min (O.3～O.8℃/min)降至-30℃，然后將冷凍后的胚胎分裝標(biāo)記放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。
10.3 解凍
從液氮罐中取出胚胎細(xì)管，在空中停留1s，放入36～38℃水浴中停留10s解凍后，用生理鹽水清洗，剪去棉塞端，與帶有空氣的1ml注射器連接上。再剪去細(xì)管的另一端封口，將胚胎推到干燥潔凈器皿內(nèi)。采用分步法脫除甘油，分別間隔5min，依次通過(guò)1摩爾、0.75摩爾、0.50摩爾、0.25摩爾的甘油磷酸鹽緩沖液，最后通過(guò)含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗2次～3次，去除甘油，移至不含甘油的PBS保存液中鏡檢待用。
10.4 胚胎細(xì)管標(biāo)記
胚胎細(xì)管應(yīng)標(biāo)記和登記。存檔資料包括胚胎系譜、代碼、保存方法、應(yīng)用單位。胚胎標(biāo)記包括序列號(hào)、父本、母本、胚胎發(fā)育期和級(jí)別及數(shù)量、胚胎生產(chǎn)單位和胚胎生產(chǎn)日期。
11 胚胎移植
分為鮮胚移植和凍胚移植。
11.1 受體牛黃體檢查
要求受體牛發(fā)情時(shí)直腸檢查的卵泡直徑在10mm～20mm左右，發(fā)情后36h出現(xiàn)排卵。黃體發(fā)育達(dá)到一級(jí)和二級(jí)發(fā)育水平的才能進(jìn)行胚胎移植。黃體發(fā)育程度判定條件如下：
11.1.1 一級(jí)黃體
黃體形態(tài)和發(fā)情天數(shù)一致，黃體呈乳頭狀突出于卵巢表面。黃體直徑2.0cm左右，約拇指大小，呈軟肉狀，排卵點(diǎn)火山口狀突起明顯。
11.1.2 二級(jí)黃體
黃體形態(tài)和發(fā)情天數(shù)基本一致。黃體直徑1.5cm 左右，約中指肚大小，呈硬肉狀，排卵點(diǎn)突起較明顯。
11.1.3 三級(jí)黃體
黃體直徑1.0cm 左右，手摸約小拇指大小，硬而突起不明顯。黃體發(fā)育不良的母牛應(yīng)及時(shí)淘汰。
11.2 受體牛的準(zhǔn)備
保定受體牛，清除便污，肌注2%靜松靈1ml或用2%的普魯卡因3ml在l～2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰，用高錳酸鉀水沖洗消毒，用滅菌紙擦干，最后經(jīng)酒精棉球消毒。
11.3 器械準(zhǔn)備
先將移植槍、槍頭及金屬保護(hù)外套分別用紙包扎好，高壓消毒。塑料卡蘇式移植槍需經(jīng)氣體滅菌。移植時(shí)先用70%酒精棉球消毒裝有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封口一端，裝入移植槍內(nèi)，套上保護(hù)外套。
11.4 移植前胚胎裝管
用0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液，中間由兩個(gè)氣泡隔開(kāi)，中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段裝管，胚胎在中段。一步吸管法解凍脫甘油后，用酒精棉球多次消毒吸管，剪去封口即可用于移植。
11.5 移植
操作員一只手伸進(jìn)直腸，另一只手持移植器插入陰道，移植器到達(dá)子宮頸口時(shí)，用力將移植槍捅破外套填片，插入子宮頸。在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭輕輕穩(wěn)妥地插入黃體一側(cè)子宮角至大彎處，持移植器的手推出胚胎，緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。
12 妊娠診斷
采用外部觀察法和直腸檢查法，執(zhí)行DB1505/T 074。